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基因文库

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分子生物学中, 一个基因文库是通过分子克隆的方法存储和繁殖微生物群的DNA片段的集合。 基因文库有很多种,包括部分基因文库(cDNA文库)、基因组文库(由基因组DNA形成),以及随机突变体库(由被替代的核苷酸或密码子结合形成的新的基因合成)。基因文库是当前分子生物学的一个主要研究方向 ,这些文库的用途取决于原始DNA片段的来源。用于文库制备的克隆载体和技术存在差异,但通常每个DNA片段都被独立地插入一个克隆载体,然后将重组DNA分子转化入受体菌群(细菌人工染色体,BAC文库)或酵母内,使得每个生物体平均含有一个构建的表达载体(载体+插入物)。随着培养的种群的数量增长,其中包含的DNA也在被不断复制。

术语

术语“文库”可以指生物群(每个生物携带插入克隆载体中的DNA分子),或者指所有克隆的载体分子的集合。

部分基因文库

部分基因文库(英語:cDNA library)是以从特定来源(细胞集合,特定组织或整个生物体)纯化的mRNA样品为模板,使用逆转录酶形成的互补DNA与适当的载体连接后转化到受体菌形成的重组菌群。因此,它一定程度上反映了来源细胞在纯化mRNA时的生理环境下活跃转录的基因。

cDNA文库可用于反向遗传学,但它们仅代表给定生物体基因组的非常小(小于1%)的一部分。

cDNA文库的应用包括:

  • 发现新基因
  • 克隆全长cDNA分子用于体外基因功能研究
  • 研究在不同细胞或组织中表达的mRNA
  • 研究不同细胞或组织中的选择性剪接

基因组文库

把某种生物的基因组的全部遗传信息(DNA)切成适当长度的片段,并分别与载体结合,导入微生物细胞,形成克隆。包含基因组中所有DNA序列的克隆的集合,称为基因组文库(英語:Genomic library)。

基因组文库的应用包括:

  • 确定给定生物的完整基因组序列(参见基因组计划
  • 作为通过基因工程产生转基因动物的基因组序列的来源
  • 体外调控序列功能的研究
  • 癌组织中基因突变的研究

构建

克隆载体

克隆载体(英語:Cloning vector)是取自病毒,质粒或高等生物的细胞的一小段DNA,可以在生物体中稳定存在,并可以插入外源DNA片段用于克隆目的。因此,载体有易将DNA片段插入载体或从载体中除去的特征,例如通过用切割DNA的限制酶处理载体和外源DNA。由此产生的DNA片段含有平末端或粘性末端,然后通过分子连接将载体DNA和具有相容末端的外源DNA连接在一起。在将DNA片段克隆到克隆载体中后,可以将其进一步亚克隆到另一种用于更具体用途的载体中。

构建基因文库常常使用的载体有λ噬菌体cosmid载体质粒人工染色体(包括酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC、P1派生人工染色体PAC等)。

载体最常在细菌细胞中繁殖,但如果使用YAC(酵母人工染色体)作为载体,则可以在酵母细胞中繁殖。载体也可以在病毒中繁殖,但这可能是耗时且繁琐的。但通过使用病毒(通常是噬菌体)实现的高转化效率使得它们可用于包装载体,然后将其导入细菌(或酵母)细胞中。

基因组文库的构建

  • 载体DNA片段的制备:使用限制性核酸内切酶对载体DNA分子进行剪切,使之成为线状DNA。
  • 供体DNA片段的制备:对生物体总DNA分离纯化,并使用机械剪切法或酶切法分离出特定大小的DNA片段。
  • 供体与载体DNA的连接:使用DNA连接酶将供体与载体连接成为重组DNA分子。
  • 重组DNA分子的转化:将重组DNA分子转化进入受体细胞。
  • 筛选与保存

cDNA文库的构建

  • 载体DNA片段的制备
  • 多聚RNA的分离与纯化
  • 双链cDNA的合成
    • 第一条cDNA链:逆转录法
    • 第二条cDNA链:碱解或酶解法除去RNA分子
  • cDNA与载体DNA相连
  • 重组cDNA分子的转移

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