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亞克隆

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亞克隆過程圖示(英文說明:Overlap extension PCR=重疊延伸PCR,Restrction Digest=(限制)酶切,Ligation=連接)

亞克隆(英語:Subcloning)是一種分子生物學技術。該技術旨在將目的片段(基因、啓動子等)導入目標載體中,以進行進一步研究。

目前,亞克隆的傳統方法主要基於兩項技術:PCR技術和限制性核酸內切酶(限制酶)酶切。除此以外,一項較新的亞克隆技術也已出現,即Infusion。該技術相比基於PCR和酶切的傳統方法具有操作簡便、快速等優點,可以實現傳統方法難以做到的亞克隆。

過程簡述

首先,使用限制酶將目的基因切下。切下來的目的基因需經過純化(常用手法是膠回收)。之後,可以通過PCR來製造一定數量的該目的基因的拷貝。

同時,需要用切割目的基因的那種限制酶切割載體,以讓載體產生與目的基因互補的黏性末端,以使得它們能在後續步驟中被DNA連接酶連接。磷酸酯酶(通常是小牛腸道鹼性磷酸酶(CIAP))在該過程中也必不可少,因爲它能去除DNA鏈5'端的磷酸基團,防止載體的自身黏合。形成的目的載體帶有兩個缺口,在轉化入感受態細菌後能被感受態細菌自行修復。之後,再對目標載體進行分離/純化。

接下來,將目的基因與載體混合,並添加DNA連接酶。通常,目的基因和載體的分子數之比設定爲5比1或10比1(也有文獻認爲應爲3比1)。目的基因與載體的數量過量都會造成不利影響。另外,目的基因也不應過長。超過10kb(千鹼基對)的話,目的基因將難以和載體有效結合。一般操作人員會把反應容器放在冰上,讓反應進行一整晚。

實際應用

利用亞克隆技術,可以將目的基因導入目標載體中,進行進一步研究。比如,如果想要研究某基因在大腸桿菌中的作用,就可以將該載體導入成熟的大腸桿菌表達載體中(如pUC9),便於後續研究的進行。如果想要研究某啓動子的控制作用,也可以將之插入特定的載體中,再進行進一步研究。

參考


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